Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC

Principe

C’est une techniques chromatographiques dont la phase mobile est
un liquide.

• Son champ d’application recouvre une grande partie du domaine de la CPG auquel s’ajoute celui de l’analyse des composés thermosensibles ou de masses moléculaires à la fois très grandes et même polaires.
• Son succès est dû à la possibilité d’agir de manière très précise sur la sélectivité entre les composés par le choix de la colonne et de la composition de l’éluant.
• l’utilisation de phases chirales ou des nouvelles phases stationnaires opérant suivant plusieurs modes, les techniques par appariement d’ions ainsi que d’interaction hydrophobe accroissent encore plus les possibilités de la CLHP.
• Enfin la miniaturisation de la technique (nanochromatographie) a facilité son association avec la spectrométrie de masse.

l’introduit des pompes capables de pousser la phase mobile à forte pression a permis de diminuer la taille des grains de la phase stationnaire, et à conféré à la technique:

• un meilleur échange entre les deux phases,
• une meilleure séparation (meilleure efficacité)
• une analyse rapide (quelques minutes < 1 heure)
• des colonnes de taille réduite
• simplification des manipulations en utilisant différents détecteurs en ligne

D’où l’appellation retenue de: Chromatographie liquide à haute performance (CLHP ou HPLC).

Appareillage en HPLC

Réservoirs de la phase mobile

• Réservoir renferme la phase mobile
• Il est en verre ou en acier inoxydable (200 à 1000 ml).
• Le réservoir doit être étanche pour éviter:
  • l’évaporation préférentielle
  • la dissolution des gaz de l’atmosphère qui se libéreraient dans le reste de l’appareil et également les opérations
• On prive la phase mobile des gaz dissous dans une cuve à ultrasons.
• On filtre la phase mobile pour éliminer toutes particules en suspension : Car tous les tubes de l’appareil ont un diamètre extrêmement fin et risquent de se boucher.

Pompes

Sert à faire passer la phase mobile rapidement dans la colonne.

• débit : 0,01 à 10 mL/min
• stabilité < 1%
• pression maximale > 350 bars

Il existe deux types:

• Les pompes à pression constante
• Les pompes à débit constant qui sont les plus utilisées.

On distingue:

• Pompes à simple déplacement : fonctionne comme une seringue : elle est munie d’un piston qui se déplace grâce à une vis sans fin. Il n’ y a pas de pulsations mais le volume de solvant est limité (quelques ml).
• Pompe à piston: (la plus utilisée) le piston est entraîné par une excentrique, le ressort pousse le piston en permanence dans le sens du remplissage du corps de la pompe.
  Avantage: grand volume, mais il y a des pulsassions

Lorsque on délivrent un solvant unique, on travaille en mode d’elution isocratique.
Si on a plusieurs solvants et que l’on veut faire un gradient du pouvoir éluant ou mode en gradient de polarité , il faut :

• Soit plusieurs pompes aspirent chacune un solvant précis
• Soit une seule pompe à plusieurs canaux où passent chaque solvant

les systèmes d’injections

Injecteur à seringue

• Il se rapproche des injecteurs utilisés en CPG.
• On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille traverse un septum en caoutchouc ou en matière plastique, pour déposer l’échantillon au sommet de la colonne qui est placée sous le septum

• Avantage : On apporte l’échantillon dans la colonne.
• Inconvénient : Il est très difficile de maîtriser le volume de la prise d’essai.

Vannes à boucle d’injection

C’est un injecteur à boucle d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents volume (10 à 100 \mu L), on utilise en général une boucle de 20\mu L.

Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser.

Le système de la boucle d’injection permet d’avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l’analyse quantitative.

• 

• 

• 

Colonnes en HPLC

En acier inoxydable rarement en verre mais toujours chimiquement inerte. La phase stationnaire est disposée à l’intérieur de la colonne où elle est retenue par une pastille en acier inoxydable fritté. Puis un tube capillaire conduit l’éluat vers le détecteur.

• Longueur de 10 à 30 cm
• diamètre interne de 4 à 20 mm
• granulométrie : 5 à 10 \mu m

les détecteurs

Ils doivent répondre à certaines exigences:

• Signal proportionnel à la concentration (linéarité)
• Sensibilité (rapport signal/bruit)
• Réponse stable dans le temps (la dérive par rapport au temps)
• Faible temps de réponse
• Faible volume mort (volume de la cellule)

Il n’existe pas de détecteur universel, mais il faut le choisir en fonction des substances analysées.

Détecteurs d’absorption en UV-Visible

Ce sont les plus utilisés. On distingue les appareils:

• à longueur d’onde fixe \lambda = 254 nm par exemple
• à longueurs d’ondes variable de 200 à 700 nm
• à barrette de diodes: analyse simultanée sur tout le spectre.

$$\begin{align}A = \log(\dfrac{I_0}{I}) = \epsilon\cdot l\cdot C\end{align}$$

Réfractomètre différentiel

Il mesure en continu la différence de l’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne. Il est peu sensible et nécessite une température parfaitement réglée à 0,01 °C près, et de travailler à débit constant.

Détecteurs de fluorescence

Détecteurs très sensibles et très sélectifs, mais il sont destinés uniquement aux solutés fluorescents ou après formation post colonne de composés fluorescents (dérivatisation).

Détection électrochimique

Ils sont réservés aux solutés dits électroactifs (ampérometrie, coulometrie, conductimétrie…) électrode indicatrice : platine, carbone vitreux. La phase mobile contient des électrolytes pour assurer le passage du courant.

Couplage à la spectrométrie de masse

• Nécessité de travailler sous vide
• Le volume de solvant doit être faible
• Usage des interfaces
• LD : 100pg-1ng

Enregistrement des chromatogrammes

• Enregistreur simple: Impose la mesure manuelle des pics pour l’analyse quantitative.
• Enregistreur – intégrateur: Obtention du chromatogramme suivi de l’inscription des aires des pics, automatiquement mesurées.

Les modalités chromatographiques en HPLC

Chromatographie d’adsorption

La phase stationnaire est un solide doué de propriétés adsorbantes, la phase mobile peut être un gaz ou un liquide.

Le gaz sert uniquement à entraîner les constituants à travers la colonne sous la pression de vapeur.

La phase mobile solubilise les constituants du mélange et les entraîne à travers la colonne.

Les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, les intéractions électrostatiques … jouent aussi un rôle dans la séparation des molécules.

phase stationnaire : silice, alumine.

• Gel de silice: ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. L’inconvénient d’une telle phase, c’est une détérioration rapide au cours du temps, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations
• Silice : adsorbant très polaire. La capacité d’adsorption et la polarité varient en fonction du taux d’hydratation.

Chromatographie de partage

Méthode fondée sur les différences entre les coefficients de partage des solutés à séparer entre deux phases liquides non miscibles.
C’est une chromatographie liquide – liquide.
La phase stationnaire liquide est retenue par:

• Adsorption sur un support solide (silice)
  inconvénient : dissolution de la silice (pH >7,5)
• Greffe sur un support : fixation par liaison chimique: on parle de phase liquide greffée (la seule utilisée).

On distingue deux types: phase normale et phase inverse

La phase normale

Gel de silice greffée: on utilise des phases stationnaires polaires : phases greffées (aminopropyl plus polaire que cyanopropyl) et des phases mobiles apolaires pour séparer des composés polaires et moyennement polaires.

• 

• 

Le pouvoir éluant d’une phase mobile est la somme des polarités de chacun des solvants.
On utilise en général un mélange de solvants: solvant apolaire (hexane, heptane…) + un solvant peu polaire (dichlorométhane, THF…) appelé modificateur polaire (MP).
Lorsque la polarité du mélange augmente, la force éluante augmente et le facteur de capacité (k’) diminue;
Plus le soluté est polaire, plus son t_r et son k’ sont élevés.

La phase inverse

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C₈ et C₁₈). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (acétonitrile: ACN, méthanol: MeOH, H₂O). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.

Chromatographie par échange d’ions

La phase stationnaire est une macromolécule (résine) portant un groupement fonctionnel acide ou basique.

La séparation d’un mélange de solutés se fait par échange des ions neutralisant la résine (Cl^–, Na⁺) contre les solutés de même signe.

Les différents types d’échangeurs d’ions: Échangeurs d’anions et échangeurs de cations.

Interviennent dans cette fixation :

• Charge de la résine.
• Charge et la taille des ions à fixer.
• Concentration des ions à séparer.
• Accessibilité aux groupements ionisés de la résine.
• Vitesse d’écoulement du liquide.

Étapes de la séparation :

• Conditionnement de la résine.
• Application du mélange de solutés.
• Fixation éventuelle des solutés à la résine = la phase stationnaire (interactions ioniques).
• Élution : entraînement des solutés par la phase mobile.

Exemple : séparation sur une résine anionique (= échangeur de cations)

Chromatographie de paire d’ions

C’est un sous type de la chromatographie en phase inverse. La phase mobile : tampon + solvant + contre ion, elle s’adresse à des molécules chargées; la charge est neutralisée grâce à un contre ion de charge contraire et possédant des chaînes alkyles.

Cette technique peut remplacer l’échange d’ions pour la séparation des molécules chargées. Elle offre la possibilité de travailler en phase inverse (technique optimale).

• Phase stationnaire apolaire
• Phase mobile: tampons + contre ions ± méthanol ou acétonitrile

Chromatographie d’exclusion

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort (V_m ou V₀).

Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée. Les solutés sont donc élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une relation linéaire entre le volume d’élution et le logarithme de la masse moléculaire.

• 

• 

• Si K_d = 0:
  • Molécules totalement exclues de la phase stationnaire.
  • Migration rapide.
  • Elles sortent en premier.
• Si 0 < K_d < 1:
  • Les molécules sont séparées par la phase stationnaire.
  • Plus elles sont petites, plus K_d est élevé donc leur temps de séjour est important.
• Si K_d = 1: Les molécules diffusent parfaitement dans la phase et sortent en dernier.
• Si K_d > 1: Un autre phénomène se rajoute à l’exclusion stérique : phénomène de partition (interaction entre soluté et phase stationnaire )

Types de gels :

• Gels hydratés: (les plus utilisés) le Séphadex^® (G10 à G200) qui sont des polyosides bactériens de type dextran (poly D-glucopyranosyl \alpha 1-6), et le Sépharose^® (agarose). Le gain d’eau correspond au nombre de grammes d’eau fixés par gramme de substance sèche.
• Gels permanents: ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux (silice). Ici, des effets d’adsorption s’ajoutent au tamisage moléculaire.

\begin{align}V_e = V_i + K_D\cdot V_p \quad\text{ soit }\quad K_D= \dfrac{V_e-V_i}{Vp} = \dfrac{V_e-V_i}{V_m-V_e}\end{align}

• V_i = Volume interstitiel = Volume d’exclusion totale: Volume de phase mobile à l’extérieur des grains de phase stationnaire \Rightarrow mesuré avec une grosse molécule ( non retenue )
• V_p = volume des pores = volume de phase mobile à l’intérieur des grains de phase stationnaire
• V_m = volume mort: Volume de phase mobile dans la colonne = V_p + V_i \Rightarrow mesuré avec une petite molécule ( fortement retenue)

Application de l’HPLC

Le domaine d’application de la technique (CLHP) est très vaste.

• Industries chimiques et para chimiques
• Agro-alimentaires
• Environnement
• Pharmacie
• Biochimie.