Généralités

Définition

La chromatographie sous toutes ses formes, est une
méthode de séparation des constituants d’un mélange gazeux, liquide ou solide. C’est une méthode de séparation, donc d’analyse, basée sur les différences d’affinités que peuvent présenter deux ou plusieurs composés pour deux phases, l’une fixe ou stationnaire et l’autre mobile.

La chromatographie est essentiellement une technique de séparation physique dont le champ d’application en analyse quantitative est restreint aux situations où la composition du mélange à séparer est connue. Pour identifier des composés séparés par chromatographie, lorsqu’on ignore tout de leur structure chimique, il est fréquent de coupler à la séparation comme telle, une technique d’analyse complémentaire comme par exemple la spectrométrie de masse ou la spectroscopie infrarouge.

La statistique ci-dessus fait apparaitre que la chromatographie, à elle seule , représente plus de la moitié du chiffre d’affaires de l’instrumentation d’analyse moléculaire.

Principe général de tous les types de chromatographie

Classement selon la nature des phases et processus mis en jeu

Phase mobile	Phase stationnaire	Méthode chromatographique
Gaz	Solide	C.G.S
Gaz	Liquide	C.G.L
Liquide	Solide	C.L.S
Liquide	Solide	C.L.L

Mécanismes	Méthodes chromatographiques
Adsorption	L.G.S et C.L.S
Partition	C.G.L et C.L.L
Échanges d’ions	C.L.S
Perméations	C.L.S

Classement selon les techniques opératoires

• Chromatographie sur couche mince ou sur papier;
• Chromatographie sur colonne;
• Chromatographie par perméation de gel ou d’exclusion (polymères);

Classement selon la méthode d’injection de l’éluât

• Chromatographie pulsée ou d’élution;
• Chromatographie frontale

Historique

Il existe peu d’exemple de développement d’un procédé ou d’une méthode aussi extraordinaire que celui de la chromatographie.
Quelques dates importantes :

• 1906 : Description et découverte de phénomène chromatographique par M. TSWETT
• 1952 : Première chromatographie gazeuse (MARTIN et JAMES)
• 1967 : Début de la chromatographie liquide haute performance (HUBER et HUZSMAN)

Buts de la chromatographie

• Chromatographie analytique : analyses qualitatives et quantitative (recherche, laboratoire, fabrication)
• Chromatographie préparative (recherche, synthèse).

Comparaison chromatographie Gazeuse/Chromatographie liquide

Les deux techniques de base de la chromatographie ne sont pas compétitives mais tout à fait complémentaires.

• Quelques avantages de la Chromatographie liquide :
  • Possibilité de chromatographier les produits thermolabiles et les produits de haute masse molaire.
  • Dérivation des produits peut être automatisée
  • Mode préparatif facile à mettre en œuvre
• Quelques avantages de la chromatographie gazeuse :
  • Détecteurs spécifiques et sensibles
  • Couplage avec spectrométrie
  • Possibilité d’analyser les produits de très faibles masses molaires.

Théorie de la chromatographie

La théorie générale de la chromatographie peut être longue et complexe à exposer. En outre, chaque méthode chromatographique possède sa théorie et ses mécanismes propres. Nous présentons seulement dans ce chapitre les grandeurs fondamentales de la chromatographie (sous toutes ses formes) qui sont des éléments théoriques indispensables au praticien.

Comment améliorer une séparation en chromatographie ?

Il y a deux possibilités pour améliorer la séparation entre les 2 pics du chromatogramme (a) :

1. A largeur de pic constante, on peut augmenter la différence de temps de rétention entre les 2 pics, ceci est illustré dans chromatogramme (b)
2. A temps de rétention constant, on peut diminuer la largeur des pics, le chromatogramme (c) illustre ce phénomène.
   En pratique, on peut jouer à la fois sur ces 2 paramètres pour améliorer une séparation.

En conclusion, deux paramètres s’avèrent donc primordiaux en chromatographie, la rétention et la forme du pic.

Paramètres caractérisant la rétention

Le chromatogramme du Prozac^® (antidépresseur) de la figure ?? a été enregistré dans les conditions suivantes :

• Colonne C18: 15cm x 4,6mm;
• Phase mobile: acetonitrile / 25mM KH₂PO₄  pH 7,0 (40:60);
• Débit: 2mL/min;
• Température: 30°C ;
• Détecteur UV : 254 nm; 
• Injection: 1L

Le temps de rétention

Le temps de rétention t_r d’un produit S est le temps écoulé entre le début de l’injection et la sortie du produit. (pour le chromatogramme de la figure ??, t_r = 3mn)
t_r dépend du produit S et des conditions expérimentales (colonne, température, débit de phase mobile… etc.)

Le volume de rétention

Le volume de rétention V_r correspond au volume de phase mobile nécessaire pour éluer le produit S.

Si D est le débit de la phase mobile (D supposé constant) :

(1)  

(pour le chromatogramme de la figure ??, V_r = 3 * 2 = 6 ml)

Le temps mort

Le temps mort t_m est le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne. (dans la figure ??, t_m = 1mn). La phase mobile est caractérisée par sa vitesse linéaire u de déplacement dans la colonne de longueur L, on a :

(2)  

(pour le chromatogramme de la figure ??, u= 15 cm/mn)

En CPG, le temps mort correspond au temps de rétention de substances non retenue par la phase stationnaire comme l’air ou le méthane.

Le volume  mort

On appelle volume mort V_m le volume de phase mobile qui passe à travers la colonne pour aller d’une extrémité à l’autre de la colonne (pendant le temps t_m). Autrement dit, V_m est le volume occupé par la phase mobile dans une colonne.

(3)  

(pour le chromatogramme de la figure ??, V_m = 1 * 2 = 2 ml). V_m ne dépend que de la géométrie et du remplissage de la colonne.

Volume et temps de rétention réduits

On appelle volume de rétention réduit ,
la différence entre les termes V_r et V_m.

(4)  

(pour le chromatogramme de la figure ??, ).
Le volume de rétention réduit correspondant au produit S est le volume de phase mobile qui doit passer à travers la colonne pour éluer ce composé.

De la même façon, on définit un temps de rétention réduit t’_r.

(5)  

(pour le chromatogramme de la figure ??, t’_r =  2 mn), les volumes et temps de rétention réduits sont indépendantes des volumes et temps morts, elles dépendent donc moins de l’instrumentation (de la colonne).

Le facteur de rétention (ou de capacité)

Si on représente la colonne de chromatographie comme un milieu hétérogène constitué de deux phases non miscibles, l’une fixe et l’autre mobile et si on introduit dans ce milieu un composé présentant des affinités envers les deux phases, il s’établira, en chaque point de la colonne, un équilibre entre la concentration de ce composé dans la phase mobile et sa concentration dans la phase stationnaire. Le rapport de ces concentrations à l’équilibre est le coefficient de partage K.
Le facteur de rétention K’ pour un produit donné est défini comme suit :

(6)  

Les facteurs de rétention sont des grandeurs sans dimension donc plus générales d’un produit donné que les temps ou les volumes de rétention réduits.
(pour le chromatogramme de la figure ??, K’ = 2).

D’où une définition du facteur de rétention d’après l’équation 6 C’est le rapport du temps passé par le soluté dans la phase stationnaire sur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobile

Interprétation thermodynamique des paramètres de rétention

La constante d’équilibre (ou constante de partition) K

Le problème est le suivant: trouver les relations entre les paramètres de rétention (V_r, K’, t’_r et t_r) et la constante d’équilibre K caractérisant l’équilibre suivant:

(7)  

L’élution d’un soluté S en chromatographie est donc caractérisé par la constante d’équilibre K, appelée aussi constante de partition.

(8)  

• m_m: Masse du soluté S dissous dans la phase mobile
• m_s: Masse du soluté S dissous dans la phase stationnaire
• V_m: Volume de la phase mobile (équivalent au volume mort)
• V_s: Volume de la phase stationnaire

V_m et V_s sont constants pour une colonne donnée avec une phase stationnaire donnée

(9)  

Le paramètre , appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une colonne de chromatographie.
sera calculé par la suite pour une colonne capillaire en chromatographie en phase gazeuse.

(10)  

Le facteur de rétention K’

(11)  

D’après l’équation 6, on déduit que si on suppose que V_r est proportionnel à la masse totale de soluté dissous dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.
On a donc V_r proportionnel à (m_s + m_m)

De la même façon, si on suppose que V_m est proportionnel à la masse de soluté dissous dans la phase mobile.
On a donc V_m proportionnel à m_m

On en déduit que

(12)  

et d’après l’équation 10, on a donc:

(13)  

ce qui nous donne une relation fondamentale de la chromatographie

(14)  

Le temps de rétention t_r

D’après les équations ?? et  14, on déduit que:

(15)  

La dernière expression est cohérente, si un produit n’a aucune affinité avec la phase stationnaire :[S_s] = 0 donc K = 0 et t_r = t_m .

Ceci est le cas de  l’air ou en première approximation du CH₄ en CPG, ce qui permet la mesure du temps mort.

Influence de la température sur les temps de rétention réduits t’_r

K varie avec la température T suivant l’équation classique 16,
où G° est la différence d’énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >> 1 donc G° est négative.

(16)  

En combinant cette expression avec l’équation 15, on trouve la relation entre le temps de rétention réduit et la température :

(17)  

Où G° est la différence d’énergie libre de dissolution du soluté entre les phases mobile et stationnaire.

Plus ΔG° (dissolution pm→ ps) est petit (grand en valeur absolue), plus la constante d’équilibre K est grande, plus le produit est retenu sur la colonne, plus le t_r est grand

D’après la figure ??, il apparaît que pour avoir une séparation chromatographique,
il faut que :
ΔG° (dissolution pm → ps) <0 soit ΔG° (dissolution  ps) < ΔG° (dissolution pm)  ou en valeur absolue ΔG° (dissolution ps) >ΔG° (dissolution pm)‌

G°(dissolution pm → ps) est fonction de la température, en effet ΔG°= ΔH° – T. ΔS°, si l’on suppose que ΔH° et  ΔS° sont indépendants de la température, la formule de l’équation 17 devient:

(18)  

Soit:        

(19)  

où A et B sont des  constantes pour un produit donné et une colonne donnée.

Considérons deux températures T₁ et T₂ où T₂ > T₁
avec les facteurs de rétention correspondants K’₁ et K’₂, la formule devient :

(20)  

Comme t’_r1 > t’_r2, on voit que ΔH° est toujours < 0.
Le temps mort t_m, peut être supposé indépendant de la température pour une colonne donnée et une pression donnée.

En réalité, lorsque la température augmente, le mouvement brownien augmente, la viscosité de la phase mobile diminue et sa vitesse augmente légèrement dans la direction de la colonne. On observe expérimentalement une faible augmentation du temps mort avec la température.

Exercices d’application

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La forme des pics en chromatographie

Au moment de l’injection, de durée (dt), le « futur » pic de chromatographie a un profil rectangulaire ;  à la sortie de la colonne, il se retrouve déformé suivant une loi statistique, approximativement « normale »,  c’est une courbe de Gauss.

• 

• 

L’équation mathématique y=f(t) de la courbe de Gauss est:

(21)  

Une courbe de Gauss est caractérisée par  les paramètres suivants: (Cf figure ??).

1. Écart-type = s.  L’écart type s correspond à la moitié de la largeur du pic mesuré à 60,6% de sa hauteur.
2. Variance = s²
3. Largeur à mi-hauteur = mesurée à h/2. On a la relation:

   (22)  

4. la « base »  du pic = . Cette base est extrapolée par des tangentes aux deux branches et passant par les points d’inflexion de la courbe de Gauss. On a la relation:

   (23)  

   
   Une conséquence de la loi statistique ( normale ) est que 95,4% des valeurs de t_r du pic se trouve dans l’intervalle[t_r – 2s ; t_r + 2s].

Modèle des plateaux théoriques

Vers 1950, MARTIN et SYNGE ont tenté de justifier la forme des pics de chromatographie, en assimilant une colonne de chromatographie à une colonne à distiller. Ce qui s’est avéré inexact par la suite (les 2 phénomènes sont physiquement différents)

Notion de plateaux théoriques

Une colonne de N plateaux théoriques est une colonne divisée en N petits disques cylindriques successifs. On admet que la phase mobile progresse non pas de façon continue, mais par sauts successifs d’un plateau théorique à l’autre. Dans chaque plateau théorique, on observe une rétention du soluté S, du fait de l’équilibre de ce produit entre la phase mobile (S_pm) et la phase stationnaire (S_ps).

Une colonne réelle aura donc « N plateaux théoriques » si elle se comporte comme une « colonne à distiller théorique » de N plateaux.
Dans cette théorie, les pics de chromatographie ont une forme gaussienne et la variance s² est reliée au nombre de plateaux théoriques N et au temps de rétention t_r par la relation:

(24)  

N augmente donc avec le temps de rétention et diminue si la largeur des pics (s) augmente. D’après la relation 24, une « bonne » colonne de chromatographie qui conduit à des pics fins (s petit) pour des temps de rétention (t_r) élevés, est donc caractérisée par un nombre de plateaux théoriques N élevé.

Formule 25 utilisant la base extrapolée [/latex]\omega[/latex] du pic

(25)  

Formule 26 utilisant la largeur à mi hauteur [/latex]\delta[/latex] du pic

(26)  

Formule 27 utilisant la hauteur hp et l’aire A du pic

(27)  

( , hp, A et t_r doivent être exprimés dans la même unité).

L’intérêt de la notion de plateaux théorique est de nous donner une idée de l’efficacité d’une colonne, mais seul l’ordre de grandeur de N est à prendre en compte. Bien que cette notion de plateaux théoriques soit issue d’une théorie qui s’est avérée inexacte, elle est toujours utilisée car c’est une notion simple et qui bien ancrée dans les habitudes des chromatographistes. Les fabriquants de colonnes donnent toujours dans les spécifications le nombre de plateaux théoriques N pour caractériser l’efficacité de leur colonne. En CPG, N est donné pour un produit donné, souvent le tridécane (C₁₃H₂₈).

Notion de hauteur équivalente à un plateau théorique

Pour exprimer l’efficacité d’une colonne de longueur L et de N plateaux théoriques, on définit la hauteur H équivalent à un plateau théorique:

(28)  

H est appelé la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT), ce paramètre varie entre 10 et 0,01 mm. Le paramètre H est intéressant car il est indépendant de la longueur de la colonne. Le tableau suivant montre le pouvoir de séparation des chromatographies les plus utilisées

Type de chromatographies	Nombre de plateaux théoriques N	N/par mètre de colonne	H (HETP) en mm
CPG (colonne remplie de 2m )	2000	1000	1
CPG (colonne capillaire de 25m)	100000	4000	0,25
CPL classique de 50 cm	100	200	5
HPLC de 10cm	5000	50000	0,02

Exercice d’application

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Théorie dynamique de la chromatographie

Équation de Van Deemter (1956)

On peut considérer dans le cas de développement d’une évolution
d’une petite quantité de produit que l’étalement du pic au fur et à mesure de sa progression dans la colonne de chromatographie est dû à trois origines indépendantes :

• la résistance au transfert de matière dans chacune des phases
• la dispersion des molécules par diffusion
• l’existence de chemins multiples dus au remplissage.

L’équation de Van Deemter relie les différentes causes d’élargissement des pics à la vitesse de la phase mobile et à la hauteur équivalente à un plateau théorique (efficacité).

Cette équation est de la forme :

(29)  

où :

• U: La vitesse linéaire moyenne de la phase mobile.
• A : Diffusion turbulente due à l’écoulement de la phase mobile à travers la phase stationnaire
• B : Diffusion longitudinale des molécules au sein de la phase mobile
• C : La résistance au transfert de masse entre les 2 phases.

En colonne capillaire (chromatographie en phase gazeuse) : A = 0

(30)  

Influence de la température :

(31)  

Trois facteurs, représentés par les 3 termes de l’équation 29, contribuent à l’élargissement des pics.

Diffusion turbulente. (Terme A)

Suivant la taille et la forme des particules, ils existent pour la phase mobile, plusieurs trajets possibles, cette particularité contribue à l’élargissement des pics, d’où:

(32)  

• l est une constante voisine de 1. 
• dp est le diamètre moyen des particules.

Donc, plus les particules sont petites et plus le remplissage est homogène, plus l’efficacité de la colonne augmente.

La contribution de A est nulle pour une colonne capillaire de chromatographie en phase gazeuse.

Diffusion longitudinale. (Terme B)

Le terme traduit la dispersion du soluté à cause de la diffusion du soluté dans la colonne.

Par exemple, dans un flux liquide, les molécules au centre du flux progressent plus vite que celles qui sont sur les bords au contact des particules; on a:

(33)  

où g est une constante (g<1). et D_m est le coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile. Le terme B/u est évidemment inversement proportionnel à U. L’efficacité d’une colonne augmente avec la vitesse de la phase mobile. Ceci peut expliquer les bonnes séparations obtenues en HPLC; de plus, comme le terme D_m est environ 5 fois plus grand en CPG qu’en CPL, il en résulte que la contribution de la diffusion longitudinale est presque négligeable en HPLC.

Résistance au transfert de masse.(Terme C)

Ce terme représente la résistance au transfert du soluté entre les phases mobiles et stationnaires, cette résistance empêche l’établissement de l’équilibre entre S_pm et S_ps. Ce phénomène est du par exemple au fait que certaines molécules stagnent dans les pores de la phase stationnaire.

Plus la vitesse (U) de la phase mobile diminue, plus les molécules de soluté peuvent pénétrer dans la phase stationnaire, plus l’équilibre entre les 2 phases est favorisé et plus la colonne est performante. Le terme C est proportionnel à , les colonnes les plus efficaces seront celles régulièrement remplies et bien tassées où le diamètre des particules est le plus faible possible. Il faut également utiliser des solvants de faible viscosité pour minimiser ce terme.

Courbe de Van Deemter

La représentation graphique de l’équation 29 est appelée courbe de Van Deemter.

Exercice d’application

Quiz ici

Facteur de séparation de deux pics

Définition du facteur de séparation

Le chromatogramme suivant montre la séparation de 2 solutés A et B.

On appelle le facteur de séparation (ou sélectivité) le terme suivant:

(34)  

dans lequel  , on a donc \alpha toujours supérieur ou égal à 1. Compte tenu de l’équation 26, on a l’expression 35, où le facteur de séparation s’exprime en fonction des facteurs de rétention. Ce facteur rend donc compte de la « proximité » des pics sans tenir compte de leur forme.

(35)  

Interprétation thermodynamique du facteur de séparation

En utilisant 34, on peut exprimer le facteur de séparation en fonction des coefficients de partition (ou constantes d’équilibre K) des solutés A et B :

(36)  

L’expression 35 permet d’obtenir le facteur de séparation en fonction de la température:

(37)  

Le terme a traduit donc la différence d’énergie libre de dissolution des solutés A et B. Comme a est très voisin de 1, on peut souvent utiliser l’expression simplifiée

(38)  

Définition du facteur de résolution

Par convention le facteur de résolution R des 2 pics A et B de la figure ??, s’écrit :

(39)  

Si on fait apparaître la largeur à mi-hauteur \delta, on a :

(40)  

Contrairement à le terme R prend en compte la forme des pics et leur recouvrement éventuel.

La figure ?? montre l’influence de la résolution R sur la séparation de 2 pics de même intensité. Pour une résolution inférieure à 0,6 les pics ne sont pas séparés. En pratique une bonne résolution suppose que R 1,5.

Dans le cas de 2 pics A et B très proches (), en combinant les expressions 25, 34 et ??, on obtient la relation de Purnell, une expression de la résolution R en fonction des 3 termes suivants à peu près indépendants les uns des autres :

1. du nombre de plateaux théoriques N (donc de l’efficacité de la colonne)
2. du facteur de séparation (donc de la « proximité » des pics)
3. du facteur de rétention k'(donc des temps de rétention des pics)

(41)  

Démonstration de la formule de Purnell.

(42)  

car   et en posant

(43)  

(44)  

(45)  

(46)  

Exercice d’application

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Optimisation des performances d’une colonne

(47)  

Paramètres déterminants la performance de la colonne :

1. modification du facteur de capacité : diminuer ou augmenter K’ changement de la composition du solvant
2. modification du facteur de sélectivité :
   • modifier la composition de la phase mobile
   • modifier la T° de la colonne
   • changer la composition de la phase stationnaire
3. augmenter N :
   • augmenter L : si L doublée, alors R augmente de mais t_r augmente
   • diminuer H :
     • diminuer le diamètre des particules support (diminuer le terme A )
     • diminuer le diamètre de la colonne (diminuer le terme C)
     • diminuer T°(chromatographie gazeuse CPG) (diminuer le terme B)
     • diminuer épaisseur du film liquide(chromatographie gazeuse CPG) (diminuer le terme C)
     • diminuer viscosité de la phase mobile ( HPLC) (diminuer le terme C)
     • optimiser ( vitesse linéaire de de la phase mobile)