Introduction

Spectroscopie d’absorption et d’émission

• Moléculaire
• Bande
• Énergie électronique
• Les molécules sont excitées puis reviennent à l’état fondamental en émettant un rayonnement lumineux

État singulet et triplet

Règle de sélection (2S+1)

• un état ou tous les électrons sont appariés = singulet
• une paire excitée forme soit un singulet ou triplet (moins énergétique que singulet).

1. état singulet (S): électrons à spins opposés M = 2S + 1 = 1
2. état triplet (T): électrons à spins parallèles M = 2S + 1 = 3

Méthode	Energie d’excitation	Emission
Chimiluminescence	Réaction chimique	Luminescence
Bioluminescence	Réaction biochimique	Luminescence
Photoluminescence	REM	Fluorescence ou Phosphorescence

Diagramme de JABLONSKI

Interprétation :

Absorption d’énergie:

Origine : S0; A t° ambiante, la majorité des molécules se trouvent au niveau de vibration le plus bas (Vo) du niveau Eo : tous les e- sont appariés : la somme des spins S = 0
Absorption d’un quantum d’énergie :
Si E est suffisamment grande: peuplement des niveaux d’énergie supérieurs:
E1, E2 S1, S2 (même phénomène : UV- visible, fluorescence, phosphorescence) 
Durée de l’excitation  S0 S1 ou Sn: 10^-15 s
État instable  relaxation

Relaxation :

Perte d’énergie: collision avec les molécules (solvant); [/latex]\Delta[/latex] E ém < [/latex]\Delta [/latex]E abs [/latex]\Longrightarrow[/latex]bande d’émission vers grandes [/latex]\lambda[/latex]

1. [/latex]\longrightarrow[/latex]S1 : 10-11 s (Sn : retour à S1 (Vo) par CI et RV (non radiatif)
2. S1 (V0) [/latex]\longrightarrow[/latex]S0 fluo. : 10-8 s S1 (V0) [/latex]\longrightarrow[/latex]S0 chal. : 10-4 s
3. l’e- change de spin: S = 1; 2S + 1 = 3 (état T) et subie deux types de transition:

• (CIS) ou (CIC). C’est une transition interdite ; donc peu probable.
• (Em. Phos.) : qqs microsec.

Position et forme des spectres

Interprétation des spectres :

L’émission de fluorescence est située à :

: transition 0 transition (S0)V0 (S1)V0 (abs) (S1)V0 (S0)V0 (ém) ( intersection spectre émission et spectre excitation)

 : Cas particulier : (loi ANTI-TOCKES)

Transition : E0 (V1), (V2) ou …(Vn) E1(abs)

Retour : E1 (V0) E0 (V0) : E grande à l’émission   L’émission de fluorescence est l’image dans un miroir de l’absorbance

Tracé des spectres:

• Spectre d’absorption = spectre d’excitation (Comparable au spectre UV – Visible)
  • Absorption UV-visible:
  • ém. fixe (Imax)
• Spectre d’émission = spectre de fluorescence
  • Emission de fluorescence:
  • fixe (Imax)

NB: Mesure de I au max de [/latex]\lambda[/latex]

Aspects quantitatifs de la fluorescence

Intensité de fluorescence (IF)

conditions de fluorescence

Pour qu’une molécule fluoresce, il faut une absorption dans l’UV proche ou le visible (absorption < 200 nm [/latex]\Longrightarrow[/latex] pas de fluorescence).
c à d que la différence entre les niveaux d’énergie ne soit pas trop grande.

Fluorescence et transitions:

• fluorescence
• phosphorescence plutôt que fluorescence
• pas de fluorescence

La durée de vie de l’état singulet doit être brève (10-9 s) sinon on a des phénomènes de conversion interne croisée.
Les états singulet et triplet doivent être bien séparés.

Molécules fluorescentes

• Les composés aliphatiques ne fluorescent pas.
• Les composés aromatiques fluorescent : la fluorescence augmente avec le nombre de cycles dans la molécule. Ex: naphtalène, anthracène.
• Les composés hétérocycliques ( N, O, S) ne sont pas fluorescents mais quand ils sont accolés à un noyau aromatique (composés indoliques) ils sont très fluorescents.

Mesure de l’intensité de fluorescence

L’échantillon est placé dans une cuve. On dirige sur cette cuve un rayonnement d’excitation de [/latex]\lambda[/latex] donnée

Une partie de la lumière est absorbée, une partie est transmise. En plus, on observe une émission de REM à une [/latex]\lambda[/latex]ém (fluorescence).

La mesure de IF se fait perpendiculairement au faisceau d’excitation; (IF se fait dans ttes les directions).

IF à [/latex]\lambda[/latex] ém est [/latex]\cong[/latex] à IA (absorbée) :

IF = [/latex]\phi[/latex]. IA ([/latex]\phi[/latex] = Rd quantique de fluo.) 

[/latex]\phi[/latex]= nbre de photons émis/nbre de photons excités.

\begin{align}
\phi&= Kf\dfrac{(MS1)}{Ka(MS0)}\\
\phi&= Kf \dfrac{(MS1)}{(MS1)}\cdot[Kf + Kisc + KCI] \\
\phi&= \dfrac{Kf}{[Kf + Kisc + KCI]} \Rightarrow 0 <\phi<1\\
&\text{Durée de vie de l’état S1 est par définition:}\\
\tau &=\dfrac{1 }{Kf+Kisc+KCI}\\
\text{et} (MS1)_t &= (MS1)_0e^{-[Kf+Kisc+ KCI]\cdot t}
\end{align}

[/latex]\Rightarrow[/latex] Evolution de la population à l’état S1 d’une molécule en fonction de t = exponentielle décroissante

Expression de IF

[/latex]IF = \phi. IA [/latex] avec: [/latex]I_A = I_0 – I_T[/latex]

[/latex]IF = \phi (I_0 – I_T) = \phi (I_0 -I_0.e^{-\varepsilon lc}) = \phi I_0(1 – e^{-\varepsilon lc}[/latex])

Approximation:

Pour des (c) faibles, telle que :A = [/latex]\varepsilon[/latex]lC < 0.05 :
e-[/latex]\varepsilon[/latex]lc = 1 – [/latex]\varepsilon[/latex]lC
IF = [/latex]\phi[/latex] Io(1 – e-[/latex]\varepsilon[/latex]lC) = [/latex]\phi[/latex]o(1 – 1 + [/latex]\varepsilon[/latex]lC)
IF = [/latex]\phi[/latex] Io [/latex]\varepsilon[/latex]lC (relation linéaire)
Si C est grande, IF n’est plus linéaire

Facteurs modifiant l’intensité

Différents facteurs expérimentaux peuvent modifier l’intensité de fluorescence.

• lumière : nature du rayonnement utilisé (exc)
• est variable en fonction de

Choisir la valeur [/latex]\lambda[/latex]max d’excitation qui correspond à IF maximum.

IF augmente avec Io; la sensibilité augmente

NB : photo-décomposition : si Io élevée [/latex]\Rightarrow[/latex] risque de casser les molécules , pas de fluorescence. (Ex :cas des nucléotides).

• mesurer IF à ém max
• l ( parcours optique) : cuve de 1 cm pour augmenter la fluorescence.

IF = f(C)

(1): deux (C)possibles pour un IF
(2): = linéaire If prop. à (C)

• Travailler en parallèle sur 1 solution diluée afin de s’assurer du résultat

Effet de la concentration Sur If

perte de linéarité pour des fortes conc. s’explique par :

• Auto inhibition : due à la collision entre les molécules d’où perte de E sous forme thermique pas de fuo.
• Effet de filtre interne: dû à l’abs. de I0 en totalité par les 1ères couches des molécules dans la cuve : les 1ères couches de la solution fluorescent (absorbent la totalité de la lumière), alors que les molécules des couches profondes ne seront pas excitées.
• Self absorption: la lumière de fluorescence est réabsorbée par les molécules environnantes

Fluorescence et structure :

Fluo naturelle: quinine, tétracycline,vit. B,E)

• Molécules insaturées (aromatiques, c=c)
• Pas de relation entre structure et fluo.
• Structure cyclique beaucoup de chance d’être fluorescente; IF augmente avec la rigidité et le nombre de cycle (pyridine, quinoléine)

Fluo non naturelle:

• Réaction hétérocyclisation (N,O) condensation d’othodiamine
• Réaction dérivation (greffer un réactif): OPA pour ;RSH Coumarine pour acide;

Influence des substituants

S’ils [/latex]\nearrow[/latex] la mobilité des e- [/latex]\pi[/latex], If [/latex]\nearrow[/latex] et inversement.

Radical	(nm)	IF
Alcoyle	0
– OH, – OR	+
– COOH, – SH	+
– NH2 , RNH	+
– NO2 , – NO	–	Inhibition
– CN	0

Facteurs externes

pH:

pour les molécules ayant un caractère acido-basique, il y a modification de la structure selon le pH ce qui entraîne une modification de la fluorescence.

Quenching : inhibition de Fluorescence

Diminution de IF sous l’effet des collisions entre les particules fluorescentes et les espèces présentes dans le milieu de mesure.

• Quenching statique: collisions à l’état S0.
• Quenching dynamique: collisions à l’état Sn
• Quenching sans collision (par couplage)

quenching par transfert d’énergie:

Ex. avec collision:

(1)  

Ex. sans collision:

*** QuickLaTeX cannot compile formula:
 \begin{align*}A^{\ast} + B \longrightarrow A + B^{\ast}(nF) &\longrightarrow + h\nu chal \Rightarrow (\text{inhibition totale}) \\ Fluo. type éosine:& \\ S1 + kT°\longrightarrow T1; T1 &\longrightarrow S1; S1 \longrightarrow S0 + h\nu F (\text{fluo retardée}) \\ Fluo. type pyrène:& \\ 2T1 \longrightarrow S1+ S0 + h \searrow P \\ S1 &\longrightarrow S0 + h \nu F ( \text{mélange de Fluo. Et Phos.})\\ &\text{quenching par transfert d'e-} Fe^{2+} : ( \text{réduction du BM^{+}}) \\Fe^{2+} + BM^{+} (F) &\longrightarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*} 

*** Error message:
Please use \mathaccent for accents in math mode.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Please use \mathaccent for accents in math mode.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Missing $ inserted.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Extra }, or forgotten $.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Extra }, or forgotten $.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Extra }, or forgotten $.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Missing $ inserted.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Extra }, or forgotten $.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}
Extra }, or forgotten $.
leading text: ...htarrow Fe^{3+} + BM^{}(n F)) \end{align*}

Solvant :

pas de relation entre nature Sv et Fluo. [/latex]\longrightarrow[/latex] tester plusieurs Sv: ex Sulfanilamides dans différents Sv:
(eau: 100; EtOH: 107; acétone: 0; isobutane: 33)

Température :

F T ([/latex]\Delta[/latex]H au lieu de F)

1°C F de à T°sup à 40°C Mesure à t0

MESURES: – Instrumentation

Schéma de principe

Conditions de mesure et erreurs

• Mesurer IF à 90°. Pour recueillir IF, on met un monochromateur à de la molécule.
• Échantillonnage:
  • travailler sur des solutions diluées dans différents solvants.
  • utiliser des produits purs et verrerie propre pour éviter la fluo parasite. (attention aux lessives…).

Dosage: mesure relative; droite d’étalonnage

Applications

Analyse qualitative

Sélective; 1seul [/latex]\lambda[/latex]max ém et 1 seul max exc./Sv; complémentaire à l’U.V-Vis. 

Analyse quantitative

• Dosage des molécules fluorescentes ou rendues fluo.(médicaments, PA…)
• Méthode sensible (plus que UV-Vis car basée sur 2 max ).
• Mesure de faibles concentrations

Exemple de dosage:

• biologie : cortisol, vitamine B2, B6.
• médicaments : sulfate de quinine, tétracycline
• dosage immuno-chimique : marquage fluorescent.

\begin{align}Ac + Ag^\circ &\rightleftharpoons Ac – Ag^\circ\\ Ac + Ag^\ast &\rightleftharpoons (Ac – Ag)^\ast \end{align}

Quand

NB : éviter la fluorescence parasite

Fluorescence résolue dans le temps: ex
Sérum fluo.[/latex]\lambda[/latex] exc : 340 nm;
Traceur (durée de vie élevée) [/latex]\lambda[/latex]exc:320 nm [/latex]\lambda[/latex]em: 618 nm; [/latex]\tau[/latex] = 200 à 500 [/latex]\mu s[/latex]
Il faut un marqueur de fluo differente ex: cryptate d’europium

Couplage: CCM, HPLC (Rx dérivation en pré ou post-colonne, rapide) pas d’automatisation.
Polarisation de fluo: appliquée à des fins analytiques ( polym; immuno.)
-obtention par prisme de Nicol [/latex]\longrightarrow[/latex] exc. et émis. Une seule et même direction
-but: différencier des molécules marquées et non marquées:
si petites molécules (redépolarisation); si grosses molécules (pas de redépolaristion); d’où signal différent

Quiz

[WpProQuiz 4]